腺病毒包裝的操作流程以及相關(guān)的技術(shù)問題

發(fā)布日期：2020-07-23 19:23

腺病毒包裝的操作流程以及相關(guān)的技術(shù)問題

腺病毒包裝

重組腺病毒是一種復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)，廣泛用于基因治療，基礎(chǔ)生命科學(xué)研究等領(lǐng)域。 重組腺病毒具有以下顯著優(yōu)勢(shì)：感染范圍廣，幾乎所有細(xì)胞系，原代細(xì)胞和某些組織均可被感染； 感染效率高達(dá)100％，可以完全超過其他病毒載體工具和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。 大源基因攜帶能力（高達(dá)8Kb）； 非整合基因組 高滴度，操作方便。 因此，重組腺病毒是最有前途的基因傳遞工具之一。  

當(dāng)前常用的腺病毒載體基于5型人腺病毒（Ad5），其基因組為36Kb長(zhǎng)的線性雙鏈DNA。 腺病毒可以通過自身的纖維（纖維）與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，被內(nèi)吞到細(xì)胞中，然后利用細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制從內(nèi)體（內(nèi)體）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，從而開始復(fù)制和復(fù)制。而腺病毒包裝下，完整的病毒生命周期將導(dǎo)致細(xì)胞死亡并釋放病毒顆粒。  

目前，最常用的腺病毒包裝系統(tǒng)是AdEasy和AdMAX。 共同特征是首先將靶基因克隆到穿梭載體中，然后重組到大腺病毒主鏈中。 這兩個(gè)系統(tǒng)在腺病毒的早期轉(zhuǎn)錄復(fù)制基因E1和E3中都有缺陷，并且E3基因?qū)τ诓《旧a(chǎn)不是必需的。 因此，腺病毒包裝必須依靠表達(dá)E1的細(xì)胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。

與Adeasy系統(tǒng)相比，AdMAX系統(tǒng)易于操作并且可以獲得更好的病毒滴度。 這些說明基于AdMAX系統(tǒng)，該系統(tǒng)由pHBAd系列穿梭質(zhì)粒和腺病毒主鏈載體pBHGloxδE1、3Cre雙載體組成。  

 Baffir Biology的腺病毒是5型血清型腺病毒，它已經(jīng)刪除了腺病毒早期表達(dá)基因序列的E1和E3區(qū)。  E1是腺病毒復(fù)制所必需的，缺少E1使其無法自行復(fù)制。 它只能依靠包裝細(xì)胞（例如HEK293細(xì)胞）提供的反式互補(bǔ)進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，以確保腺病毒的安全性。  E3基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可以對(duì)抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng)，而E3區(qū)域的去除可以降低宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)。流行病應(yīng)對(duì)。  

 Baffir的腺病毒包裝使用最新的AdMax系統(tǒng)，通過Cre-loxp重組酶，將腺病毒載體穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒（腺病毒基因組）共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞質(zhì)粒中）在重組酶的作用下產(chǎn)生重組腺病毒， 所得病毒滴度較高，病毒滴度可達(dá)1×10 ^ 12pfu / ml。 布法羅生物系統(tǒng)的腺病毒載體有CMV，mCMV，CAG，PGK，UbC，EF1a和許多其他啟動(dòng)子可供選擇； 并且有許多熒光標(biāo)記蛋白，例如EGFP，ZsGreen，tdTomato，mCherry，EYFP等。  

原理是同源重組。 將目標(biāo)基因表達(dá)盒插入腺病毒的左臂區(qū)域（通常缺少E1基因區(qū)域）以形成腺病毒穿梭質(zhì)粒，然后用腺病毒基因組（通常缺失）將攜帶E1基因區(qū)域的細(xì)胞與大質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染 例如，在293細(xì)胞中，這兩個(gè)質(zhì)粒通過在293細(xì)胞中的同源重組形成重組腺病毒基因組，并包裝成病毒顆粒。 主要缺點(diǎn)是重組效率較低。  

與目前最流行的AdEasy系統(tǒng)相比，具有一定的優(yōu)勢(shì)：AdMax系統(tǒng)僅需2-4周即可完成從質(zhì)粒構(gòu)建到病毒重組的整個(gè)過程，成功率大于98％  （其中95％的克隆包含靶基因），因?yàn)樵摬《驹谡婧思?xì)胞中重組，因此它維持了腺病毒生存的壓力，從而有助于重組腺病毒基因組的完整性。  AdEasy系統(tǒng)的成功率只有18-34％（Stratagene的新版本AdEasy XL系統(tǒng)的成功率約為94％），病毒基因組在原核細(xì)胞中重組（BJ5183）。 從理論上講，失去生存壓力的腺病毒基因組更容易發(fā)生突變，病毒的遺傳背景和活性可能會(huì)受到影響。  

腺病毒包裝的主要困難是如何在腺病毒主鏈載體上構(gòu)建外源基因表達(dá)盒或外源shRNA表達(dá)盒。 由于腺病毒主鏈載體相對(duì)較大（> 30kb），并且在載體中幾乎有多個(gè)共同的限制性酶切位點(diǎn)，因此，如果通過常規(guī)限制性連接方法將外源基因或shRNA表達(dá)盒構(gòu)建到腺病毒中， 成功率很低。 因此，目前的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)基本上使用同源重組將外源基因或shRNA表達(dá)盒構(gòu)建到腺病毒骨架載體上。  

 HonorGene的病毒打包平臺(tái)技術(shù)團(tuán)隊(duì)在腺病毒打包方面擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)。 自腺病毒包裝技術(shù)服務(wù)發(fā)展以來，已成功包裝了數(shù)百種各種類型的腺病毒，成功率高達(dá)99％； 包裝的最大靶基因超過4k； 腺病毒滴度不低于109pfu / ml，訂購1ml基本可以滿足您的實(shí)驗(yàn)需求。